CRiSPR e síndrome dup15q
-De Dra. Stormy Chamberlain
Membro do Conselho Consultivo Profissional da Dup15q Alliance
University of Connecticut Health Center, Farmington, CT, Professor Associado, Genética e Ciências do Genoma
Diretor Associado, Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia do Desenvolvimento
ATUALIZADO: 3/10/2020
O CRISPR é uma ótima ferramenta para o laboratório, mas seu uso como terapêutico para Dup15q provavelmente está longe e não é o ideal. Embora o corte CRISPR seja extremamente eficiente, usar o CRISPR para excluir o cromossomo duplicado ou segmento de cromossomo completamente é incrivelmente ineficiente - mesmo no laboratório. Começamos com 1 milhão de células e só às vezes obtemos o cromossomo idico excluído. Nunca excluímos o cromossomo intersticial. Seria necessário que esse processo ineficiente funcionasse perfeitamente em muitos neurônios individuais no cérebro, sem cometer erros. Eu mencionei que é ineficiente?
Não poderíamos excluir / alterar um gene de cada vez? Sim, exceto que ainda não sabemos qual gene seria - e provavelmente mais de um. Também não podemos controlar quantas das 3-4 cópias de um gene ele atingiria. Mesmo para mudar um gene, o CRISPR ficaria em um neurônio por um longo tempo, cortando o DNA de maneira eficiente que não deveria. Os reparos desses cortes estão cheios de erros, que podem levar a situações perigosas, como mutações e câncer. Existem maneiras melhores do que o corte de DNA CRISPRs para reduzir a produção de genes, como ASOs, siRNAs, miRNAs, regulação epigenética, etc…. É provável que sejam mais seguros, eficazes e mais rápidos de serem desenvolvidos como terapêuticos do que o CRISPR.
Dito isso, há outras abordagens CRISPR que podem ser mais provavelmente desenvolvidas como uma terapia para Dup15q. Eles usam um CRISPR “morto” que não corta o DNA. Em vez disso, este CRISPR morto pode ser usado para trazer reguladores para genes específicos para diminuir sua produção. Existem também CRISPRs que cortam o RNA em vez do DNA e podem reduzir a produção de genes específicos. Ouvimos sobre isso em nosso simpósio científico em 2018. Existem alguns riscos para os CRISPRs de corte de RNA, também, mas não tanto quanto os CRISPRs de corte de DNA.
No contexto da publicação recente sobre o uso de CRISPRs sendo injetados diretamente no olho, (https://www.nature.com/articles/d41586-020-00655-8) os pesquisadores afirmaram no comunicado de imprensa que “A ferramenta de edição de genes permanece no olho e não viaja para outras partes do corpo, então “se algo der errado, a chance de dano é muito pequena”, disse ele. “É um bom primeiro passo para fazer a edição de genes no corpo.”
A razão pela qual eles podem fazer isso no olho é que eles podem remover o olho, se algo ruim / perigoso (ou seja, mutações extras que levam ao câncer). O olho também é imunoprivilegiado - o que significa que há muito pouca reação imunológica no olho. Em outras partes do corpo, o sistema imunológico vai reagir à proteína CRISPR, que é mais um obstáculo enorme para a CRISPR superar antes de ser usada como terapia em humanos. As células sanguíneas são prontamente CRISPRed porque podem ser removidas, editadas por uma breve exposição CRISPR e, em seguida, confirmadas para edição pretendida e ausência de mutação perigosa. As células alteradas corretamente podem ser expandidas para produzir mais delas e substituídas em um ser humano. Isso é chamado de edição ex vivo e não pode ser feito para neurônios. As células cerebrais não podem ser removidas do corpo, expandidas e substituídas.
Finalmente, um cientista divulgou recentemente seu trabalho entregando CRISPRs para os cérebros de camundongos com síndrome do X Frágil usando nanopartículas (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6544395/) Eles usaram o CRISPR para transformar o gene que codifica mGluR5, que demonstrou ajudar na síndrome do X Frágil em modelos de camundongos da doença. Embora tenham mostrado que podiam usar o CRISPR para transformar um único gene no cérebro, eles usaram o corte sujo / perigoso seguido pelo processo de reparo sujeito a erros para fazer isso. Eles não olharam para o que mais estava mutado e não seguiram os camundongos para consequências de longo prazo.
É importante ressaltar que eles não mudaram o problema genético que causou o X Frágil, mas sim um alvo a jusante que pode ter outras consequências indesejadas. Este alvo, mGluR5, também pode ser inibido de forma eficiente usando drogas tradicionais de pequenas moléculas, e existem ensaios clínicos em andamento para testar essas drogas em humanos. Não parece sensato usar um CRISPR permanente e perigoso para atingir um objetivo simples que não é curativo - é como usar uma marreta para realizar uma delicada cirurgia cerebral. Claro, o paciente pode não ter o problema cerebral de antes, mas agora existem potencialmente muitos outros problemas e você nem mesmo resolveu o problema principal.
A Aliança Dup15q se dedica a apoiar a avaliação das tecnologias existentes de terapia genética e impulsionar o desenvolvimento de novas tecnologias. Estamos extremamente orgulhosos de que este seja o objetivo principal de nossa concessão CZI recentemente concedida, que se concentra em variantes complexas do número de cópias, como dup15q, onde muitos genes são afetados.
Consulte as Perguntas frequentes sobre genética:
1/30/2018
CRISPR é uma tecnologia empolgante que já revolucionou a ciência de laboratório e provavelmente revolucionará a medicina no futuro. As abordagens baseadas em CRISPR podem ser divididas em dois temas principais: edição do genoma, que muda os pares de bases reais do DNA no genoma de uma célula e alteração da expressão do gene, que muda a quantidade de um gene ou proteína produzida, mas não muda a sequência do próprio DNA.
No laboratório, estamos usando a versão de edição de genoma do CRISPR para transformar genes individuais, excluir uma cópia inteira da região 15q11-q13 ou nos livrar do cromossomo isodicêntrico em linhas de células-tronco pluripotentes induzidas por Dup15q. Essas são ferramentas de laboratório excelentes, mas a tecnologia ainda não é eficiente ou segura o suficiente para ser usada como uma abordagem terapêutica.
Também estamos usando a outra versão do CRISPR para ativar ou reprimir genes especificamente. Nesta versão, a proteína Cas9, que geralmente corta o DNA, é alterada para que não possa cortar o DNA. No entanto, essa proteína ainda pode ser direcionada para um local específico no genoma. Grupos anexaram cargas diferentes a essa proteína para ativar genes silenciosos ou silenciosos ou para amortecer genes altamente expressos (ruidosos). Temos desenvolvido esta abordagem para aumentar ou diminuir o UBE3A em nossas linhas de células-tronco pluripotentes induzidas. Ainda não aplicamos isso às células Dup15q, mas se funcionar bem, faremos isso no futuro.
As abordagens terapêuticas que utilizam o CRISPR ainda são uma saída no futuro. Embora alguns grupos os tenham usado terapeuticamente, até agora isso se limitou às células do sangue, onde podem retirar uma célula, usar o CRISPR em um prato e depois devolver a célula ao paciente. Isso não é realmente viável para distúrbios que envolvem o sistema nervoso central. Para abordagens terapêuticas, os componentes CRISPR terão que ser entregues usando um vírus, como AAV. Os laboratórios estão trabalhando nisso, mas o mecanismo CRISPR é um pouco grande para as abordagens atuais. Também existem preocupações sobre os efeitos fora do alvo - o CRISPR pode editar o DNA em lugares que não deveria - o que pode aumentar o risco de câncer e outros problemas. Finalmente, alguns se preocupam com a edição acidental da linha germinativa - óvulos e espermatozóides - o que pode causar mudanças não intencionais nas gerações futuras. Este é um grande dilema ético enfrentado pela terapêutica CRISPR.
No entanto, o progresso continuará a ser feito para desenvolver a terapêutica usando os dois tipos de abordagens CRISPR. Eles provavelmente levarão mais tempo para serem desenvolvidos e testados do que algumas outras abordagens terapêuticas promissoras. Por exemplo, oligonucleotídeos antisense (ASOs) e RNAs em gancho curto (shRNAs) podem ser usados atualmente para alterar a expressão do gene de uma forma direcionada e reversível. Ambos os tipos de abordagens já são usados na clínica para outros transtornos. Se soubermos em qual (is) gene (s) nos concentramos, essas podem ser abordagens mais promissoras para a síndrome de Dup15q.