CRiSPR och dup15q syndrom
-Förbi Dr Stormy Chamberlain
Ledamot i Dup15q Alliance Professional Advisory Board
University of Connecticut Health Center, Farmington, CT, docent, genetik och genomvetenskap
Biträdande chef, forskarutbildning i genetik och utvecklingsbiologi
UPPDATERAD: 3-10-2020
CRISPR är ett bra verktyg för laboratoriet, men det är troligtvis långt borta och inte idealiskt att använda det som ett läkemedel för Dup15q. Även om CRISPR-skärning är extremt effektivt är det otroligt ineffektivt att använda CRISPR för att radera det duplicerade kromosom- eller kromosomsegmentet, även i laboratoriet. Vi börjar med en miljon celler och får ibland bort den idiska kromosomen. Vi har aldrig fått bort den interstitiella kromosomen. Man skulle behöva denna ineffektiva process för att fungera precis rätt i många enskilda nervceller i hjärnan utan några misstag. Nämnde jag att det är ineffektivt?
Kunde vi inte ta bort / ändra en gen i taget? Ja, förutom att vi fortfarande inte vet vilken gen det skulle vara - och det är sannolikt mer än en. Vi kan inte heller kontrollera hur många av de 3-4 exemplar av en gen som den skulle träffa. Även för att ändra en gen skulle CRISPR vara i ett neuron under lång tid och effektivt skära DNA som det inte borde skära. Reparationerna av dessa nedskärningar är fulla av fel, vilket kan leda till farliga situationer som mutationer och cancer. Det finns bättre sätt än DNA-skärande CRISPR för att minska genproduktionen, såsom ASO, siRNA, miRNA, epigenetisk reglering, etc. ... Dessa kommer sannolikt att vara säkrare, effektivare och snabbare att utvecklas som terapeutiska än CRISPR.
Med det sagt finns det andra CRISPR-tillvägagångssätt som kan vara mer benägna att utvecklas som en terapi för Dup15q. Dessa använder en "död" CRISPR som inte skär DNA. Istället kan denna döda CRISPR användas för att få regulatorer till specifika gener för att minska deras produktion. Det finns också CRISPR som skär RNA istället för DNA och kan minska produktionen från specifika gener. Vi hörde om dessa vid vårt vetenskapliga symposium 2018. Det finns också vissa risker för RNA-skärande CRISPR, men inte lika mycket som DNA-skärande CRISPR.
I samband med den senaste publikationen om användningen av CRISPR som injiceras direkt i ögat, (https://www.nature.com/articles/d41586-020-00655-8) uppgav forskarna i pressmeddelandet att ”Genredigeringsverktyget stannar i ögat och reser inte till andra delar av kroppen, så "om något går fel är risken för skada väldigt liten", sa han. "Det ger ett bra första steg för att göra genredigering i kroppen."
Anledningen till att de kan göra detta i ögat är att de kan ta bort ögat, om något dåligt / farligt (dvs extra mutationer som leder till cancer) händer. Ögat är också immunprivilegierat - vilket innebär att det finns väldigt lite immunreaktion i ögat. På andra håll i kroppen kommer immunsystemet att reagera på CRISPR-proteinet, vilket är ytterligare ett enormt hinder för CRISPR att övervinna innan det används som en terapi hos människor. Blodceller CRISPRed lätt eftersom de kan tas bort, redigeras av en kort exponering CRISPR, och sedan bekräftas för avsedd redigering och brist på farlig mutation. De korrekt förändrade cellerna kan sedan expanderas för att producera fler av dem och ersättas till en människa. Detta kallas ex vivo redigering och kan inte göras för nervceller. Hjärnceller kan inte tas bort från kroppen, expanderas och bytas ut.
Slutligen publicerade en forskare nyligen sitt arbete med att leverera CRISPR till hjärnan hos möss med Fragile X-syndrom med hjälp av nanopartiklar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6544395/). De använde CRISPR för att mutera genen som kodar för mGluR5, vilket har visat sig hjälpa till med Fragile X-syndrom i musmodeller av sjukdomen. Även om de visade att de kunde använda CRISPR för att mutera en enda gen i hjärnan, använde de den smutsiga / farliga skärningen följt av den felbenägna reparationsprocessen för att göra detta. De tittade inte på vad som annars muterades och följde inte mössen för långsiktiga konsekvenser.
Viktigt är att de inte förändrade det genetiska problemet som orsakade Fragile X utan snarare ett nedströmsmål som kan få andra oavsiktliga konsekvenser. Detta mål, mGluR5, kan också hämmas effektivt med traditionella småmolekylläkemedel, och det pågår kliniska prövningar för att testa dessa läkemedel på människor. Det verkar inte klokt att använda en permanent och farlig CRISPR för att uppnå ett enkelt mål som inte är botande - det är som att använda en slägga för att utföra känslig hjärnkirurgi. Visst, patienten kanske inte har hjärnproblemet de hade tidigare, men nu finns det potentiellt många andra problem, och du fixade inte ens det primära problemet.
Dup15q Alliance är dedikerad till att stödja utvärderingen av befintlig genterapiteknik och driva utvecklingen av ny teknik framåt. Vi är oerhört stolta över att detta är det primära syftet med vårt nyligen tilldelade CZI-bidrag som fokuserar på komplexa kopianummervarianter som dup15q där många gener påverkas.
1/30/2018
CRISPR är en spännande teknik som redan har revolutionerat laboratorievetenskap och sannolikt kommer att revolutionera medicin i framtiden. CRISPR-baserade tillvägagångssätt kan delas in i två huvudteman: genomredigering, som förändrar de faktiska DNA-basparen i genomet i en cell och förändring av genuttryck, som ändrar hur mycket av en gen eller ett protein som produceras, men ändras inte sekvensen för själva DNA: t.
I laboratoriet använder vi genomredigeringsversionen av CRISPR för att mutera enskilda gener, för att radera en hel kopia av 15q11-q13-regionen eller för att bli av med den isodicentriska kromosomen i Dup15q-inducerade pluripotenta stamcellinjer. Dessa är fantastiska labverktyg, men tekniken är inte tillräckligt effektiv eller säker nog att använda som en terapeutisk metod ännu.
Vi använder också den andra versionen av CRISPR för att aktivera eller undertrycka gener specifikt. I den här versionen ändras Cas9-proteinet, som vanligtvis skär DNA, så att det inte kan klippa DNA. Emellertid kan detta protein fortfarande riktas mot en specifik plats i genomet. Grupper har fäst olika last till detta protein för att aktivera tysta eller tysta gener eller för att dämpa starkt uttryckta (höga) gener. Vi har utvecklat detta tillvägagångssätt för att vända UBE3A upp eller ner i våra inducerade pluripotenta stamcellinjer. Vi har ännu inte tillämpat detta på Dup15q-celler, men om det fungerar bra, kommer vi att göra det i framtiden.
Terapeutiska metoder med hjälp av CRISPR är fortfarande en väg ut i framtiden. Medan vissa grupper har använt dem terapeutiskt har detta hittills varit begränsat till blodceller, där de kan ta ut en cell, använda CRISPR i en skål och sedan returnera cellen till patienten. Detta är inte riktigt genomförbart för störningar som involverar centrala nervsystemet. För terapeutiska metoder måste CRISPR-komponenterna levereras med ett virus, såsom AAV. Labs arbetar med detta, men CRISPR-maskineriet är lite för stort för de nuvarande metoderna. Det finns också oro för effekter utanför målet - CRISPR kan redigera DNA på platser som det inte är tänkt att göra - vilket kan öka risken för cancer och andra problem. Slutligen oroar sig vissa för att oavsiktligt redigera könslinjen - ägg och spermier - som kan göra oavsiktliga förändringar för kommande generationer. Detta är ett stort etiskt dilemma för CRISPR-terapi.
Ändå kommer framsteg att fortsätta att göras för att utveckla terapier med båda typerna av CRISPR-metoder. De tar sannolikt längre tid att utveckla och veterinär än några andra lovande terapeutiska metoder. Exempelvis kan antisense-oligonukleotider (ASO) och korta hårnåls-RNA (shRNA) alla för närvarande användas för att ändra genuttryck på ett riktat och reversibelt sätt. Båda dessa typer av metoder används redan i kliniken för andra störningar. Om vi vet vilken eller vilka gen vi ska fokusera på kan det vara mer lovande metoder för Dup15q syndrom.