CRiSPR und Dup15q-Syndrom

-Durch Stormy Chamberlain

Mitglied des professionellen Beirats der Dup15q Alliance

Gesundheitszentrum der Universität von Connecticut, Farmington, CT, außerordentlicher Professor für Genetik und Genomwissenschaften
Assoziierter Direktor, Graduiertenprogramm für Genetik und Entwicklungsbiologie

AKTUALISIERT: 3 

CRISPR ist ein großartiges Werkzeug für das Labor, aber seine Verwendung als Therapeutikum für Dup15q ist wahrscheinlich weit entfernt und nicht ideal. Obwohl das CRISPR-Schneiden äußerst effizient ist, ist die Verwendung von CRISPR zum Löschen des duplizierten Chromosoms oder Chromosomensegments insgesamt unglaublich ineffizient - selbst im Labor. Wir beginnen mit 1 Million Zellen und bekommen nur manchmal das idische Chromosom gelöscht. Wir haben das interstitielle Chromosom noch nie gelöscht bekommen. Man würde diesen ineffizienten Prozess brauchen, um in vielen einzelnen Neuronen des Gehirns ohne Fehler genau richtig zu funktionieren. Habe ich schon erwähnt, dass es ineffizient ist?  

Könnten wir nicht jeweils ein Gen löschen / ändern?  Ja, außer wir wissen immer noch nicht, welches Gen das sein würde - und es ist wahrscheinlich mehr als eines. Wir können auch nicht kontrollieren, wie viele der 3-4 Kopien eines Gens es treffen würde. Selbst um ein Gen zu verändern, würde CRISPR lange Zeit in einem Neuron sein und DNA effizient schneiden, die es nicht schneiden sollte. Die Reparaturen dieser Schnitte sind voller Fehler, die zu gefährlichen Situationen wie Mutationen und Krebs führen können. Es gibt bessere Möglichkeiten als das Schneiden von CRISPRs durch DNA, um die Genproduktion zu reduzieren, wie z. B. ASOs, siRNAs, miRNAs, epigenetische Regulation usw. Diese sind wahrscheinlich sicherer, effektiver und lassen sich schneller als Therapeutikum entwickeln als CRISPR.  

Es gibt jedoch andere CRISPR-Ansätze, die möglicherweise eher als Therapie für Dup15q entwickelt werden. Diese verwenden ein "totes" CRISPR, das keine DNA schneidet. Stattdessen kann dieses tote CRISPR verwendet werden, um Regulatoren zu bestimmten Genen zu bringen, um deren Produktion zu verringern. Es gibt auch CRISPRs, die eher RNA als DNA schneiden und die Produktion aus bestimmten Genen reduzieren können. Wir haben auf unserem wissenschaftlichen Symposium 2018 davon gehört. Es gibt auch einige Risiken für RNA-schneidende CRISPRs, aber nicht so viele wie für DNA-schneidende CRISPRs.   

Im Zusammenhang mit der jüngsten Veröffentlichung über die Verwendung von CRISPRs, die direkt in das Auge injiziert werden,https://www.nature.com/articles/d41586-020-00655-8) stellten die Forscher in der Pressemitteilung fest, dass „Das Gen-Editing-Tool bleibt im Auge und wandert nicht in andere Körperteile. „Wenn also etwas schief geht, ist die Wahrscheinlichkeit eines Schadens sehr gering“, sagte er. "Es ist ein guter erster Schritt für die Gen-Bearbeitung im Körper." 

Der Grund, warum sie dies im Auge tun können, ist, dass sie das Auge entfernen können, wenn etwas Schlimmes / Gefährliches (dh zusätzliche Mutationen, die zu Krebs führen) passiert. Das Auge ist auch immunprivilegiert - was bedeutet, dass das Auge nur eine sehr geringe Immunreaktion aufweist. An anderen Stellen im Körper reagiert das Immunsystem auf das CRISPR-Protein, eine weitere große Hürde, die CRISPR überwinden muss, bevor es beim Menschen als Therapie eingesetzt wird. Blutzellen können leicht CRISPRed werden, da sie entfernt, durch eine kurze CRISPR-Exposition bearbeitet und dann auf beabsichtigte Bearbeitung und das Fehlen einer gefährlichen Mutation bestätigt werden können. Die korrekt veränderten Zellen können dann erweitert werden, um mehr von ihnen zu produzieren, und in einen Menschen ersetzt werden. Dies wird als Ex-vivo-Bearbeitung bezeichnet und kann nicht für Neuronen durchgeführt werden. Gehirnzellen können nicht aus dem Körper entfernt, erweitert und ersetzt werden.    

Schließlich veröffentlichte eine Wissenschaftlerin kürzlich ihre Arbeit zur Lieferung von CRISPRs an das Gehirn von Mäusen mit Fragile X-Syndrom unter Verwendung von Nanopartikeln (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6544395/). Sie verwendeten CRISPR, um das für mGluR5 kodierende Gen zu mutieren, von dem gezeigt wurde, dass es beim Fragile X-Syndrom in Mausmodellen der Störung hilft. Obwohl sie zeigten, dass sie CRISPR verwenden können, um ein einzelnes Gen im Gehirn zu mutieren, verwendeten sie das schmutzige / gefährliche Schneiden, gefolgt von dem fehleranfälligen Reparaturprozess, um dies zu tun. Sie sahen sich nicht an, was sonst noch mutiert war, und folgten den Mäusen nicht für langfristige Konsequenzen. 

Wichtig ist, dass sie nicht das genetische Problem geändert haben, das Fragile X verursacht hat, sondern ein nachgeschaltetes Ziel, das andere unbeabsichtigte Konsequenzen haben kann. Dieses Ziel, mGluR5, kann auch mit herkömmlichen niedermolekularen Arzneimitteln wirksam gehemmt werden, und es gibt laufende klinische Studien, um diese Arzneimittel beim Menschen zu testen. Es scheint nicht ratsam, ein permanentes und gefährliches CRISPR zu verwenden, um ein einfaches Ziel zu erreichen, das nicht heilend ist - es ist wie die Verwendung eines Vorschlaghammers, um eine heikle Gehirnoperation durchzuführen. Sicher, der Patient hat möglicherweise nicht das Gehirnproblem, das er zuvor hatte, aber jetzt gibt es möglicherweise viele andere Probleme, und Sie haben das Hauptproblem nicht einmal behoben.

Die Dup15q Alliance hat sich zum Ziel gesetzt, die Evaluierung bestehender Gentherapie-Technologien zu unterstützen und die Entwicklung neuartiger Technologien voranzutreiben. Wir sind unglaublich stolz darauf, dass dies der Hauptzweck unseres kürzlich gewährten CZI-Stipendiums ist, das sich auf komplexe Kopienzahlvarianten wie dup15q konzentriert, bei denen viele Gene betroffen sind.

Siehe FAQ zu Genetik:

1/30/2018

CRISPR ist eine aufregende Technologie, die die Laborwissenschaft bereits revolutioniert hat und wahrscheinlich in Zukunft die Medizin revolutionieren wird. CRISPR-basierte Ansätze können in zwei Hauptthemen unterteilt werden: Genomeditierung, die die tatsächlichen DNA-Basenpaare im Genom einer Zelle verändert, und Veränderung der Genexpression, die die Produktion eines Gens oder Proteins verändert, sich jedoch nicht ändert die Sequenz der DNA selbst.

Im Labor verwenden wir die Genom-Editing-Version von CRISPR, um einzelne Gene zu mutieren, eine vollständige Kopie der 15q11-q13-Region zu löschen oder das isodizentrische Chromosom in Dup15q-induzierten pluripotenten Stammzelllinien zu entfernen. Dies sind großartige Laborwerkzeuge, aber die Technologie ist noch nicht effizient oder sicher genug, um als therapeutischer Ansatz verwendet zu werden. 

Wir verwenden auch die andere Version von CRISPR, um Gene spezifisch zu aktivieren oder zu unterdrücken. In dieser Version wird das Cas9-Protein, das normalerweise DNA schneidet, so verändert, dass es die DNA nicht schneiden kann. Dieses Protein kann jedoch immer noch auf einen bestimmten Ort im Genom gerichtet sein. Gruppen haben unterschiedliche Ladung an dieses Protein gebunden, um stille oder leise Gene zu aktivieren oder hochexprimierte (laute) Gene zu dämpfen. Wir haben diesen Ansatz entwickelt, um UBE3A in unseren induzierten pluripotenten Stammzelllinien nach oben oder unten zu drehen. Wir haben dies noch nicht auf Dup15q-Zellen angewendet, aber wenn es gut funktioniert, werden wir versuchen, dies in Zukunft zu tun. 

Therapeutische Ansätze mit CRISPR sind auch in Zukunft ein Ausweg. Während einige Gruppen sie therapeutisch verwendet haben, war dies bisher auf Blutzellen beschränkt, bei denen sie eine Zelle herausnehmen, CRISPR in einer Schale verwenden und die Zelle dann an den Patienten zurückgeben können. Dies ist bei Störungen des Zentralnervensystems nicht wirklich möglich. Für therapeutische Ansätze müssen die CRISPR-Komponenten unter Verwendung eines Virus wie AAV abgegeben werden. Die Labore arbeiten daran, aber die CRISPR-Maschinerie ist für die aktuellen Ansätze etwas zu groß. Es gibt auch Bedenken hinsichtlich nicht zielgerichteter Effekte - CRISPR kann die DNA an Stellen bearbeiten, an denen dies nicht vorgesehen ist -, was das Risiko für Krebs und andere Probleme erhöhen kann. Schließlich machen sich einige Sorgen, dass die Keimbahn - Eier und Sperma - versehentlich bearbeitet werden könnte, wodurch zukünftige Generationen unbeabsichtigt verändert werden könnten. Dies ist ein großes ethisches Dilemma für CRISPR-Therapeutika. 

Dennoch werden weiterhin Fortschritte bei der Entwicklung von Therapeutika erzielt, die beide Arten von CRISPR-Ansätzen verwenden. Die Entwicklung und Überprüfung wird wahrscheinlich länger dauern als bei einigen anderen vielversprechenden therapeutischen Ansätzen. Beispielsweise können derzeit Antisense-Oligonukleotide (ASOs) und kurze Haarnadel-RNAs (shRNAs) verwendet werden, um die Genexpression gezielt und reversibel zu verändern. Beide Ansätze werden in der Klinik bereits für andere Erkrankungen eingesetzt. Wenn wir wissen, auf welche Gene wir uns konzentrieren sollen, könnten dies vielversprechendere Ansätze für das Dup15q-Syndrom sein.