CRiSPR en dup15q-syndroom

-Door Dr.Stormy Chamberlain

Lid van de Dup15q Alliance Professional Advisory Board

University of Connecticut Health Center, Farmington, CT, universitair hoofddocent, genetica en genoomwetenschappen
Associate Director, Graduate Programme in Genetics and Developmental Biology

BIJGEWERKT: 3-10-2020 

CRISPR is een geweldig hulpmiddel voor het laboratorium, maar het gebruik ervan als therapeutisch middel voor Dup15q is waarschijnlijk ver weg en niet ideaal. Hoewel CRISPR-knippen buitengewoon efficiënt is, is het gebruik van CRISPR om het gedupliceerde chromosoom of chromosoomsegment helemaal te verwijderen ongelooflijk inefficiënt - zelfs in het laboratorium. We beginnen met 1 miljoen cellen en krijgen slechts af en toe het idische chromosoom verwijderd. We hebben het interstitiële chromosoom nooit verwijderd. Je zou dit inefficiënte proces nodig hebben om zonder fouten in veel individuele neuronen in de hersenen te werken. Had ik al gezegd dat het inefficiënt is?  

Kunnen we niet één gen tegelijk verwijderen / veranderen?  Ja, behalve dat we nog steeds niet weten welk gen dat zou zijn - en het is waarschijnlijk meer dan één. We hebben ook geen controle over hoeveel van de 3-4 exemplaren van een gen het zou raken. Zelfs om één gen te veranderen, zou CRISPR lange tijd in een neuron zitten en efficiënt DNA snijden dat het niet zou moeten knippen. De reparatie van deze sneden zit vol met fouten, wat kan leiden tot gevaarlijke situaties zoals mutaties en kanker. Er zijn betere manieren dan DNA-snijden van CRISPR's om de genproductie te verminderen, zoals ASO's, siRNA's, miRNA's, epigenetische regulatie, enz…. Deze zijn waarschijnlijk veiliger, effectiever en sneller te ontwikkelen als therapeutisch middel dan CRISPR.  

Dat gezegd hebbende, er zijn andere CRISPR-benaderingen waarvan de kans groter is dat ze worden ontwikkeld als een therapie voor Dup15q. Deze gebruiken een "dode" CRISPR die geen DNA snijdt. In plaats daarvan kan deze dode CRISPR worden gebruikt om regulatoren naar specifieke genen te brengen om hun productie te verminderen. Er zijn ook CRISPR's die RNA knippen in plaats van DNA en die de productie van specifieke genen kunnen verminderen. We hoorden hierover op ons wetenschappelijke symposium in 2018. Er zijn ook enkele risico's aan RNA-snijdende CRISPR's, maar niet zoveel als DNA-snijdende CRISPR's.   

In de context van de recente publicatie over het gebruik van CRISPR's die rechtstreeks in het oog worden geïnjecteerd, (https://www.nature.com/articles/d41586-020-00655-8) verklaarden de onderzoekers in het persbericht dat "De tool voor het bewerken van genen blijft in het oog en reist niet naar andere delen van het lichaam, dus "als er iets misgaat, is de kans op schade erg klein", zei hij. "Het is een goede eerste stap voor het bewerken van genen in het lichaam." 

De reden dat ze dit in het oog kunnen doen, is dat ze het oog kunnen verwijderen als er iets ergs / gevaarlijks gebeurt (dwz extra mutaties die tot kanker leiden). Het oog is ook immunologisch geprivilegieerd, wat betekent dat er heel weinig immuunreactie in het oog is. Elders in het lichaam zal het immuunsysteem reageren op het CRISPR-eiwit, wat weer een gigantische hindernis is die CRISPR moet overwinnen voordat het als therapie bij mensen wordt gebruikt. Bloedcellen worden gemakkelijk CRISPRed omdat ze kunnen worden verwijderd, bewerkt door een korte blootstelling CRISPR en vervolgens worden bevestigd voor beoogde bewerking en het ontbreken van gevaarlijke mutaties. De correct gewijzigde cellen kunnen vervolgens worden uitgebreid om er meer van te produceren en in een mens te vervangen. Dit wordt ex vivo bewerken genoemd en kan niet worden gedaan voor neuronen. Hersencellen kunnen niet uit het lichaam worden verwijderd, uitgebreid en vervangen.    

Ten slotte publiceerde een wetenschapper onlangs haar werk door CRISPR's af te leveren aan de hersenen van muizen met het Fragile X-syndroom met behulp van nanodeeltjes (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6544395/). Ze gebruikten CRISPR om het gen te muteren dat codeert voor mGluR5, waarvan is aangetoond dat het helpt bij het Fragile X-syndroom in muismodellen van de aandoening. Hoewel ze lieten zien dat ze CRISPR konden gebruiken om een ​​enkel gen in de hersenen te muteren, gebruikten ze hiervoor het vuile / gevaarlijke snijden gevolgd door het foutgevoelige reparatieproces. Ze keken niet naar wat er nog meer was gemuteerd en volgden de muizen niet voor gevolgen op de lange termijn. 

Belangrijk is dat ze niet het genetische probleem veranderden dat Fragile X veroorzaakte, maar eerder een stroomafwaarts doelwit dat andere onbedoelde gevolgen kan hebben. Dit doelwit, mGluR5, kan ook efficiënt worden geremd met behulp van traditionele geneesmiddelen met kleine moleculen, en er zijn lopende klinische onderzoeken om deze geneesmiddelen bij mensen te testen. Het lijkt niet verstandig om een ​​permanente en gevaarlijke CRISPR te gebruiken om een ​​eenvoudig doel te bereiken dat niet genezend is: het is alsof je een voorhamer gebruikt om een ​​delicate hersenoperatie uit te voeren. Natuurlijk heeft de patiënt misschien niet het hersenprobleem dat hij eerder had, maar nu zijn er mogelijk veel andere problemen, en je hebt het primaire probleem niet eens opgelost.

De Dup15q Alliance zet zich in om de evaluatie van bestaande gentherapie-technologieën te ondersteunen en de ontwikkeling van nieuwe technologieën vooruit te helpen. We zijn ongelooflijk trots dat dit het primaire doel is van onze onlangs toegekende CZI-subsidie ​​die zich richt op complexe varianten van het aantal kopieën, zoals dup15q, waarbij veel genen worden aangetast.

Zie Veelgestelde vragen over genetica:

1/30/2018

CRISPR is een opwindende technologie die al een revolutie teweeg heeft gebracht in de laboratoriumwetenschap en die in de toekomst waarschijnlijk een revolutie teweeg zal brengen in de geneeskunde. Op CRISPR gebaseerde benaderingen kunnen worden onderverdeeld in twee hoofdthema's: genoombewerking, waarbij de feitelijke DNA-basenparen in het genoom van een cel worden gewijzigd, en wijziging van genexpressie, waardoor de hoeveelheid van een gen of eiwit wordt gewijzigd, maar niet verandert de volgorde van het DNA zelf.

In het laboratorium gebruiken we de genoombewerkingsversie van CRISPR om individuele genen te muteren, om een ​​volledige kopie van het 15q11-q13-gebied te verwijderen of om het isodicentrische chromosoom in door Dup15q geïnduceerde pluripotente stamcellijnen te verwijderen. Dit zijn geweldige laboratoriumtools, maar de technologie is nog niet efficiënt genoeg of veilig genoeg om als therapeutische benadering te gebruiken. 

We gebruiken ook de andere versie van CRISPR om specifiek genen te activeren of te onderdrukken. In deze versie is het Cas9-eiwit, dat meestal DNA knipt, veranderd zodat het het DNA niet kan knippen. Dit eiwit kan echter nog steeds op een specifieke plaats in het genoom worden gericht. Groepen hebben verschillende ladingen aan dit eiwit gehecht om stille of stille genen te activeren of om sterk tot expressie gebrachte (luide) genen te dempen. We hebben deze benadering ontwikkeld om UBE3A omhoog of omlaag te brengen in onze geïnduceerde pluripotente stamcellijnen. We hebben dit nog niet toegepast op Dup15q-cellen, maar als het goed werkt, zullen we proberen dat in de toekomst te doen. 

Therapeutische benaderingen met CRISPR zijn nog steeds een uitweg in de toekomst. Hoewel sommige groepen ze therapeutisch hebben gebruikt, is dit tot nu toe beperkt gebleven tot bloedcellen, waar ze een cel kunnen verwijderen, CRISPR in een schaal kunnen gebruiken en de cel vervolgens terug kunnen geven aan de patiënt. Bij aandoeningen van het centrale zenuwstelsel is dit niet echt haalbaar. Voor therapeutische benaderingen zullen de CRISPR-componenten moeten worden afgeleverd met behulp van een virus, zoals AAV. Labs werken hieraan, maar de CRISPR-machine is iets te groot voor de huidige benaderingen. Er zijn ook zorgen over off-target effecten - CRISPR kan het DNA bewerken op plaatsen waar het niet hoort - die het risico op kanker en andere problemen kunnen verhogen. Ten slotte maken sommigen zich zorgen over het per ongeluk bewerken van de kiembaan - eieren en sperma - die onbedoelde veranderingen kunnen aanbrengen in toekomstige generaties. Dit is een belangrijk ethisch dilemma waarmee CRISPR-therapieën worden geconfronteerd. 

Desalniettemin zal er vooruitgang blijven worden geboekt bij de ontwikkeling van therapieën met behulp van beide typen CRISPR-benaderingen. Ze zullen waarschijnlijk meer tijd nodig hebben om zich te ontwikkelen en te onderzoeken dan sommige andere veelbelovende therapeutische benaderingen. Antisense oligonucleotiden (ASO's) en korte haarspeld-RNA's (shRNA's) kunnen bijvoorbeeld allemaal worden gebruikt om genexpressie op een gerichte en omkeerbare manier te veranderen. Beide soorten benaderingen worden in de kliniek al gebruikt voor andere aandoeningen. Als we weten op welk (e) gen (en) we ons moeten concentreren, zijn dit misschien meer veelbelovende benaderingen voor het Dup15q-syndroom.